12月22日晚，由《中华传染病杂志》主办，微远基因承办的“2021年mNGS十大文献”评选之感染精准医学年终盘点活动于京港感染论坛直播课堂落下帷幕。本次会议作为2021年中国mNGS解读联盟收官之作，特邀北京协和医院徐英春教授、复旦大学附属华山医院张文宏教授、中国医学科学院王健伟教授、浙江大学医学院附属邵逸夫医院俞云松教授担任会议主席。
广州医科大学附属第一医院卓超教授、同济大学附属东方医院吴文娟教授、北京大学人民医院王辉教授、上海交通大学医学院附属瑞金医院瞿介明教授、复旦大学附属华山医院王明贵教授、原美国纪念斯隆凯特琳肿瘤医院汤一苇教授担任会议主持，由临床、检验专家和资深行业人士共同展望mNGS 2.0时代，现摘录精华以飨读者。
复旦大学附属华山医院艾静文博士首先回望2021年发表的mNGS共识，涵盖临床、生信、检验和脑脊液mNGS应用等方面，并分享4篇候选文献。文献涉及mNGS协助诊断利什曼病、评估与常规微生物检测技术差异、血浆游离DNA检测效能等方面的文章。最后艾博士对mNGS 应用进行展望，建议进一步细化mNGS临床适用范围，规范临床送检标准等。
接下来，北京协和医院张栋从检验角度出发，介绍了实验室自建诊断下呼吸道感染mNGS技术和分析平台的文章。然后，通过分享一篇关于病毒mNGS背景解析的文章，提出了降低mNGS污染解决方案。另一方面，也通过分享干实验流程的干货文章，指出目前注释软件在丰度计算上存在差异，可能影响mNGS报告结果。
浙江大学医学院附属第一医院韩东升博士开篇强调现阶段mNGS本地化开展的必要性，援引今年见刊的中检院mNGS试剂质量评价研究以及国家卫健委临检中心的室间质评成果，指出mNGS检测流程复杂，亟待标准化。呼吁各个相关专业人士共同解决临床转化过程中面临的技术和临床问题。
最后，浙江大学医学院附属第一医院周华教授站在临床角度分享了6篇候选文献。包括胡必杰教授团队发表的mNGS临床应用综述，两篇肺部感染和两篇中枢神经系统感染应用文章。此外，他还介绍了一篇mNGS和WES技术联用辅助诊断新生儿脑炎的文章，进一步拓展了mNGS应用场景。周教授指出，随着mNGS技术优化的改进，病原捕获宏基因组测序可提升mNGS检测性能。
四位讲者介绍完20篇mNGS候选文献后，2021年mNGS十大文献评选正式启动。会议讨论环节，由九位来自临床和检验的专家和资深行业人士共同展望mNGS未来发展方向。
我们在mNGS技术认知、发展和临床应用方面，已经和国际基本同步，甚至在某些方面走在了他们的前面，说明国内临床、微生物检验和感染的同道在微生物诊断方面做出了很多努力。从临床角度出发，如何让标本采集标准化以获得准确的结果或如何正确的报告解读至关重要。临床医生需要结合患者病情，建议特定人群在恰当时机正确采样和送检mNGS。也希望今后的mNGS指征更加明确，采样方法和分析等环节更加标准。
mNGS技术可以较为快速地进行病原学诊断，解决部分疑难感染问题，获得了临床的普遍认可。但目前存在以下问题：一方面，该技术稳定性有待提高。同一份标本不同实验室检测结果可能存在差异。另一方面，该技术自动化有待加强。 “标本进，结果出”的模式可能对人力等成本的节省有一定优势。未来mNGS在耐药基因检测、感染机制和微生态方面可以进一步延伸，也希望该技术在保证稳定性的前提下尽量降低费用，走向基层医疗机构。
鉴于湿实验和干实验的污染无法完全避免，可以通过相应生信分析将污染序列识别并排除在外以避免假阳性；针对干实验环节的非特异性比对，建议构建相应数据库以去除。此外，数据库的准确性和完整性非常关键。目前细菌数据库较真菌、病毒、寄生虫数据库的构建较为完善，但寄生虫数据库还缺乏更多的信息，需要更多的努力。
经过5年的不断探索和应用经验积累，我们已经充分了解到mNGS的优势和局限性。过去，该方法学主要价值和贡献在于病原体鉴定领域。当延伸到感染的三角关系时，从耐药基因，毒力因子到宿主反应，一定要结合随机测序和病原捕获宏基因组测序技术。未来也需要进行大量的科学研究，以学术的严谨和服务临床的态度，勇于跨界，多与临床、微生物实验室、感染病学、基因检测等多领域同仁携手推进mNGS发展。
mNGS技术是全流程、多链条的工作。从标准化角度出发，第一需要做的是mNGS性能确认的标准化，以达到临床期望检测性能。其次需要标准化的是临床路径，包括临床医生开单、患者及样本类型选择、DNA流程还是RNA流程选择等，形成可落地的SOP文件。第三是实验室内部的湿实验和干实验两个层面的标准化。最后是报告解读的标准化，包括报告规则设置以及需要临床参与的MDT讨论的标准化。
就目前单中心mNGS技术重复性来讲，目前传统mMGS技术是在宿主占比极高的样本中随机抽样的过程，这就导致目前单中心mNGS技术仍存在较大的波动性。以多中心角度去探究，同一个标准品的样本序列数可能存在超过1个量级的差异，该结果提示我们在检出低序列结果时，传统mMGS重复性差异显著，这也是为何微远基因要开发病原捕获宏基因组测序的原因之一。另一方面也提示我们，当多中心差异超过1个量级时，比较不同实验室的结果或进行定量分析时一定要非常谨慎，不宜对序列数的高低做过度解读。
从实验室角度看，标准化涉及样本前处理、建库自动化、生信分析等，这几个环节的标准化决定了在技术解读方面如何看待mNGS报告的阈值问题。从临床角度看，区分定植和感染一直以来都是一个临床难题，不管是传统的培养、PCR方法还是目前的mNGS技术，都需要临床医生结合患者免疫状态、用药情况等进行综合考量。当然，从技术发展方向看，未来可能需要细化探究病种特异的mNGS、样本类型特异的mNGS，还有针对临床可能重点关注的病原体进行靶向捕获等。
mNGS技术在中枢神经系统感染性疾病诊断中有较好的敏感性和特异性，也就意味着，当出现阴性结果时，mNGS阴性预测值较高，对排除感染具有一定意义，自身免疫性脑炎的验后概率也更高。就临床适应症来说，由于其可及性和检测能力的提升，对于病因不明、经验治疗效果不佳、重症、免疫缺陷（抑制）的脑炎、脑膜炎和脑脓肿患者，建议首选脑脊液mNGS送检。期望未来能够将脑脊液mNGS检测技术与自身免疫性脑炎检查等其他检测方法融合，通过MDT模式探讨中枢神经系统感染性疾病诊断。
除了mNGS标准化等工作外，我们目前正在进行mNGS测序成本的测算，希望通过标准化技术准入，能够在保质保量的情况下避免低价驱逐良币，让mNGS技术在大环境下形成良性发展。目前广东临检中心和医保等相关部门正在积极进行沟通，希望能够给大家更好的体验。从临床角度出发，提倡大家不要忽视传统微生物检测技术，需要根据不同的方法学特点综合考量。
