近日，《协和医学杂志》围绕“检验医学技术新进展”主题，发表题为“临床微生物快速检测新技术发展现状与前景”的综述。
北京协和医院徐英春教授为文章通讯作者，宁雅婷博士、杨启文教授等共同撰文，微远基因CEO李永军先生对该文章宏基因组测序部分给予建议。
文章论述了微生物快速鉴定与药物敏感性检测最新技术研究现状、问题及未来发展要点，旨在为临床微生物实验室未来新技术的引入提供参考。
感染性疾病起病急、进展快，早期精准识别和监测病原体耐药性对患者预后及遏制耐药至关重要。临床微生物常规技术已无法满足快速诊疗的需求，因此快速检测技术成为检验与临床关注的焦点。
新型快速鉴定或直接样本检测技术
微生物鉴定是病原诊断的基础，尽早获得病原体的种或属，可为临床感染性疾病早期有针对性地采用恰当治疗方案提供重要依据。传统方法为分离培养和镜检，对检验人员的经验性技能要求高，且报告时间长。随着生物技术的发展，新型快速鉴定技术不断涌现。
宏基因组测序
宏基因组测序(mNGS)无须培养，直接抽提感染标本中病原体核酸进行高通量测序，通过基因组比对分析，确定标本中微生物的种属和定量。mNGS可全面覆盖上万种微生物，无偏向性快速鉴定细菌、真菌和病毒等多种病原微生物。此外，mNGS在罕见病原体诊断和新发未知病原体检测、溯源与变异监控方面也发挥重要作用，如曼氏裂头蚴、 新型冠状病毒的发现。
mNGS亦对耐药及毒力基因分析进行了探索，但受技术本身影响(测序深度不够)，可能会漏检临床标本中低浓度微生物，故目前对耐药及毒力基因分析仍较难实现。未来可优化方法去除人源宿主核酸以提升微生物基因组比例，或靶向捕获富集。
2021年，国家卫生健康委员会临床检测中心启动了下呼吸道宏基因组学检测室间质评研究，mNGS正在走向规范化与全流程自动化。此外， 未来将通过mNGS与宏转录组学、随机测序与靶向测序技术联用，实现病原体鉴定分型与相对定量、耐药基因与毒力因子分析以及宿主转录组学与免疫应答分析，从病原、药物和宿主3个维度进行病原检测与感染诊断。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight massspectrometry, MALDI-TOF MS)对分纯后单菌落的鉴定已非常成熟，对常见病原细菌或酵母菌的鉴定准确率高达95%，但对苛养、厌氧菌等难培养菌的鉴定准确率稍低（75%-90%)，尤其对非脆弱类杆菌的鉴定误差较大。丝状真菌由于细胞壁复杂且现有数据库菌种涵盖范围有限，采用MALDI-TOF MS鉴定效果较差。此外，MALDI-TOF MS对临床罕见病原的鉴定效果较好，联合16S rRNA测序补充鉴定，细菌鉴定准确率可达95.4%；联合核糖体DNA测序，酵母菌鉴定准确率高达99%。
直接样本鉴定方面，目前MALDI-TOF MS对血培养阳性样本的直接鉴定较为成熟，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌属水平鉴定准确率分别为80.5%和90.2％，种水平60.5%和72.3%，可显著提高菌血症患者24h内接受最佳抗菌药物的治疗率；值得注意的是，低载菌量的脑脊液、尿液和胸腹腔积液需先短期培养或富集，再行MALDI-TOF MS快速鉴定。
当然，MALDI-TOF MS目前仍存在诸如对于混合菌的鉴定准确率不高、近亲缘关系菌种分辨率不高、直接鉴定所需菌量较高等问题，未来随着菌种图谱的积累和样本前处理的优化，其有望逐步取代传统的生化编码鉴定方法。
光谱技术
光谱技术基于微生物的光谱特征，可明确其结构和组成。与传统微生物技术相比，光谱技术具有高特异度、高分辨率、对微生物无损伤且操作简便等独特优势。目前应用于临床微生物领域的光谱技术主要有拉曼光谱、近红外光谱、高光谱图像和激光诱导击穿光谱，具体原理及应用见表1。
电化学生物传感器
电化学生物传感器与传统PCR核酸检测方法相比，该技术具有便携性、快速性、简便性和低成本的优势，可直接应用于样本，无需复杂的样本前处理，对环境要求不高，普通实验室环境即可操作。该技术可直接鉴定原始样本中的病原体，使细菌鉴定时间缩短至1h内；且可在3.5h内获得多种抗菌药物的药物敏感性检测结果，既保留了表型分析的真实性，又兼具分子检测的敏感性和特异性。
未来研究重点应是突破批量样本检测的瓶颈，达到自动化上样分析，并将药物敏感性检测与结果分析整合，实现 “单芯片实验室”运行模式。
综合性分子诊断平台
综合性分子诊断平台是以PCR技术为基础， 样本处理、核酸检测及分析一体化的“样本进、结果出”高度自动化病原诊断平台，基本可实现1h 报告结果，特异度及灵敏度高，操作简单安全，所有提取、扩增和检测步骤均在芯片的不同通道中完成，最大程度减少了污染的发生，同时保证操作人员的安全性。随着整体成本下调，其在临床常规工作中必将获得广泛应用。
新型快速药物敏感性检测技术
微生物具有高度异质性，同时生态环境压力、药物选择压力和宿主免疫压力加速了菌株变异，目前耐药性发展的速度已远超新药研制速度。而常规检测方法，如纸片扩散法、浓度梯度稀释法和肉汤稀释法，耗时均较长(至少18h)，亟需快速药物敏感性检测技术，以减少抗菌药物经验性治疗期，遏制耐药发生。目前已有的快速药物敏感性检测技术依据检测原理可分为以表型为基础和以基因型为基础两类。
新型表型药物敏感性检测技术
由于微生物表型变化迅速，新型表型药物敏感性检测技术侧重以检测抗菌药物作用下病原菌生长阻滞情况作为指标，以判断耐药性或检测药物敏感性。该类方法可直接观察细菌在体外对抗菌药物的敏感和耐受情况，是在传统药物敏感性检测基础上充分开发的结果。
在基因型药物敏感性检测技术未完善和明确定论前，这种“中间技术” 的可行性较大，临床实施时间更早，但与基因型检测技术相比，检测速度受限。限制该类方法应用的主要问题为检测所需样本菌量较高，降低接种量或从低菌量样本中纯化的技术仍是药物敏感性检测技术发展中的巨大挑战。
新型基因型药物敏感性检测技术
新型基因型药物敏感性检测技术是直接从临床样本中检测与耐药性相关的基因表达量或突变情况，其对生长缓慢(如真菌)或难培养的病原体具有重要价值。
目前新型基因型药物敏感性检测技术仍以PCR或核酸探针矩阵为基础，对反应体系和条件进行优化，以提高检测速率和通量，如错配扩增突变分析PCR、高分辨率溶解度实验等。该类方法检测时间短，可定量分析，并可明确耐药机制，但仍存在诸如由于遗传异质性大、耐药机制复杂多样导致的临床工作庞杂等普遍性问题。此外，新型基因型药物敏感性检测技术尚不能用于临床迫切需求的新型耐药菌检测。目前，新型基因型药物敏感性检测技术尚未在临床实践中普及应用，该技术仍需进一步临床观察及标准化。
小结与展望
随着医疗环境的改善和生物技术的飞速发展，快速精准诊疗已成为临床关注的重点。实际临床应用中，新型微生物快速检测技术需在保证灵敏度和特异度的情况下最大程度缩短周转时间，同时具备低成本、操作简单和高通量等特点。
未来从以下3个方面实现突破：
①突破检测上样菌量局限，扩大“直接从样本中进行检测” 的适用样本范围，并提高检测准确率，节约分离培养的时间；
②联合表型和基因型药物敏感性检测技术，实现无偏倚检测，在快速测定最小抑菌浓度药物敏感性检测值的同时，明确其耐药机制，为今后靶向药物开发与研究提供临床信息基础；
③实现同一仪器、一步加样即可完成鉴定及耐药性检测。
因此，投入较少的时间对现有技术进行快速科研优化与应用改进，使之尽早获得临床认可是首要任务，以便具有优异性能特征的新技术能够快速上市。
